fa تولید انگلهای نوترکیب لیشمانیا تروپیکا بیان کننده دو پروتئین گزارشگرEGFP و لوسیفراز انگل شناسی Parasitology تحقیقی Research <p dir="RTL" style="text-align:justify;text-justify:inter-ideograph;line-height:16.0pt;"><span style="font-family:times new roman;"><strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">سابقه و هدف:</span></span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">انگل <em>لیشمانیا تروپیکا</em> عامل بروز لیشمانیوز پوستی و احشایی در ایران است. بعلت فقدان یک آزمون دقیق، حساس و غیرتهاجمی در مدل حیوانی، درمان و واکسیناسیون برعلیه آن با چالش بزرگی همراه است. لذا در این مطالعه، <em>لیشمانیا تروپیکا</em> با دو ژن گزارشگر پروتئین فلورسنت سبز (</span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">egfp</span></span></em><span style="font-size:10.0pt;">) و لوسیفراز (</span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">luc</span></span></em><span style="font-size:10.0pt;">) به شکل اتصال یافته (</span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">egfp-luc</span></span></em><span style="font-size:10.0pt;">) ترانسفکت شد تا در مطالعات آتی بعنوان یک ابزار تشخیصی سریع و دقیق برای ردیابی و اندازه گیری میزان عفونت در بدن حیوان زنده مورد استفاده قرار گیرد. </span></span></p> <p dir="RTL" style="line-height:16.0pt;"><span style="font-family:times new roman;"><strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">مواد و روش&shy;ها:</span></span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">در این مطالعه آزمایشی-تجربی، سازه ژنی حاوی ژنهای </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">egfp-luc</span></span></em> <span style="font-size:10.0pt;">از طریق نوترکیبی مشابه در ژنوم سویه ایرانی انگل <em>لیشمانیا تروپیکا</em> (در لوکوس </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">18srRNA</span></span><span style="font-size:10.0pt;">) درج شد. برای غربالگری انگلهای ترانسفکت شده، از شاخص انتخابی </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">G418</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> استفاده گردید. سپس بوسیله </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> با پرایمرهای مختلف ژنوتیپ انگلها بررسی شد. همچنین با استفاده از وسترن بلات، میکروسکوپ فلورسنت و فلوسایتومتری بیان پروتئینهای گزارشگر ارزیابی شد.</span></span></p> <p dir="RTL" style="line-height:16.0pt;"><span style="font-family:times new roman;"><strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">یافته &shy;ها:</span></span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">مشاهدات اولیه فنوتیپی انگل با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت نشان داد که انگلهای نوترکیب </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">L. tropica</span></span></em>^{<span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">EGFP-LUC</span></span>} <span style="font-size:10.0pt;">پروتئین </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">EGFP</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> را در سیتوپلاسم تولید کرده اند. میزان کمی شدت فلورسنت اندازه گیری شده در انگلهای نوترکیب با استفاده از فلوسایتومتری بیش از 90% بود. نتایج آزمونهای </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">PCR</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> ورود ژنها را بدرون ژنوم و لوکوس مربوطه و وسترن بلات بیان هر دو ژن را در شکل پروماستیگوت انگل نشان دادند.</span></span></p> <p dir="RTL" style="line-height:16.0pt;"><span style="font-family:times new roman;"><strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">نتیجه&shy; گیری:</span></span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">این اولین گزارش مبنی بر تولید</span> <span style="font-size:10.0pt;">انگلهای نوترکیب <em>لیشمانیا تروپیکا</em> بیان کننده هر دو ژن گزارشگر</span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">egfp</span></span></em> <span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;و </span><em><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">luc</span></span></em><span style="font-size:10.0pt;"> بطور همزمان است.</span></span></p> <p dir="ltr" style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">BACKGROUND</span></span></strong> <strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">AND</span></span></strong> <strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">OBJECTIVE:</span></span></strong> <em><span style="font-size:10.0pt;">L. tropica</span></em><span style="font-size:10.0pt;"> is the major cause of cutaneous and visceral leishmaniasis in Iran. Due to lack of an accurate, sensitive and noninvasive detection test in animal model is a major problem. Here, we designed <em>L. tropica</em> stably transfected with two reporter genes as fused form, enhanced green fluorescent protein (<em>egfp</em>) and Luciferase (<em>luc</em>), named as <em>egfp-luc</em> to use as a specific tools for detection and measurement of parasite load in live animals.</span><br> <strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">METHODS:</span></span></strong><span style="font-size:10.0pt;"> In an experimental study, linearized cassette containing <em>egfp-luc</em> genes was stably integrated into Iranian strain of wild-type <em>L. tropica</em> genome, 18srRNA locus, by homologous recombination. Transfectants were screened by G418 resistance, confirmed by PCR and western blotting and the expression of EGFP signals were observed by fluorescent microscope and flow cytometry.</span><br> <strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">FINDINGS:</span></span></strong><span style="font-size:10.0pt;"> Primary phenotype observations of parasite (by fluorescent microscopy and flow cytometry) were shown that recombinant <em>L. tropica</em>^EGFP-LUC was successfully produced EGFP protein into cytoplasm. Quantification of EGFP intensity was more than 90%. Furthermore, the results of PCR and western blotting verified the proper integration into genome and expression of both genes in promastigotes.</span><br> <strong><span style="color:blue;"><span style="font-size:10.0pt;">CONCLUSION:</span></span></strong><span style="font-size:10.0pt;"> This is the first report to show the generation of recombinant <em>L. tropica</em>^EGFP-LUC expressing two reporter genes simultaneously.</span></span><br> &nbsp;</p> لیشمانیا تروپیکا, لیشمانیوز پوستی, ترانسفکشن, ژنهای گزارشگر, پروتئین فلورسنت سبز, لوسیفراز, فلوسایتومتری, میکروسکوپ فلورسنت Leishmania Tropica, Cutaneous Leishmaniasis, Transfection, Reporter Genes, Egfp, Luciferase, Flow Cytometry, Fluorescent Microscopy 58 64 http://jbums.org/browse.php?a_code=A-10-3111-1&slc_lang=fa&sid=1 T Taheri طاهره طاهری tahereh_t@yahoo.com 100319475328460026473 100319475328460026473 Yes Department of Immunotherapy and Leishmania Vaccine Research, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش ایمنوتراپی و تحقیقات واکسن لیشمانیا، انستیتو پاستور ایران M Eskandar مهدیه اسکندر s_rafati@yahoo.com 100319475328460026474 100319475328460026474 No Department of Immunotherapy and Leishmania Vaccine Research, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش ایمنوتراپی و تحقیقات واکسن لیشمانیا، انستیتو پاستور ایران S Rafati سیما رأفتی mahdieh.eskandar@yahoo.com 100319475328460026475 100319475328460026475 No Department of Immunotherapy and Leishmania Vaccine Research, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش ایمنوتراپی و تحقیقات واکسن لیشمانیا، انستیتو پاستور ایران