fa کلونینگ و بیان فرم جهش یافته و غیرفعال توکسین بوردتلا پرتوسیس سویه بومی ایران میکروبیولوژی Microbiology تحقیقی Research <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong>سابقه و هدف:</strong></span> سیاه سرفه بیماری حاد و مسری دستگاه تنفسی به ویژه در نوزادان و کودکان و یکی از ده عامل عمده مرگ ناشی از بیماری های عفونی است. علیرغم کاهش ابتلا به دلیل واکسیناسیون با باکتری کشته شده عامل بیماریزا (<em><span dir="LTR">Bordetella</span></em><em><span dir="LTR"> pertussis</span></em>)، افزایش بیماری در دهه اخیر بیانگر باز پدیدی ناشی از تنوع ژنتیکی باکتری و ناکارمدی واکسن های کنونی است. بنابراین طراحی واکسنهای جدید و موثر بر پایه سویه های شایع هر جمعیت امری ضروری است. در این مطالعه پروتئین نوترکیب عیر فعال مهمترین آنتی ژن باکتریایی (توکسین پرتوسیس،<span dir="LTR">PTX</span>) سویه شایع بیماریزا در ایران بر پایه نسل جدید واکسنهای غیر سلولی تولید شد.</span></p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong>مواد و روش</strong><strong>&shy;</strong><strong>ها</strong><strong>:</strong></span> سویه باکتری مورد استفاده در این مطالعه جهت استخراج ژنوم و تکثیر ژن، از بین سویه های بیماریزای جدا شده از بیماران ایرانی از آزمایشگاه مرجع سیاه سرفه بخش میکروب شناسی انستیتو پاستور ایران انتخاب شده است. پس از کشت باکتری و استخراج <span dir="LTR">DNA</span> ژنومیک، قطعه <em><span dir="LTR">ptx-s1</span></em> (ناحیه فعال آنزیمی<span dir="LTR">PTX</span>) تکثیر و در 18<span dir="LTR">pUC</span> کلون و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، جهش زایی هدفمند آرژنین 9 به لیزین و گلوتامیک اسید 129 به گلیسین انجام و با تعیین توالی ارزیابی شد. قطعه جهش یافته در سیستم &ndash;<em><span dir="LTR">E.coli</span></em><span dir="LTR"> BL21</span> <span dir="LTR">pET15b</span> و جایگاههای &nbsp;<em><span dir="LTR">Bam</span></em><span dir="LTR">H&Iota;/<em>Nde</em></span><span dir="LTR">I</span>با 5/0 <span dir="LTR">mM IPTG</span> القا و بیان شد. سپس توسط<span dir="LTR">SDS-PAGE </span>&nbsp;و ایمونوبلات ارزیابی شد<span dir="LTR">.</span> خالص سازی با کروماتوگرافی تمایلی انجام و غلظت پروتئین مشخص شد..</span></p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong>یافته</strong><strong>&shy;</strong><strong>ها</strong><strong>:</strong></span> جهش های<span dir="LTR"> Glu129Lys, </span><span dir="LTR">Arg9Gly </span>با تعیین توالی تایید شد. وجود باند<span dir="LTR">28kDa </span>در ژل و ایمونوبلات با استفاده از آنتی بادی<span dir="LTR">Anti-His </span>&nbsp;بیان پروتئین تایید کرد. پروتئین به مقدار<span dir="LTR">mg/ml</span> 0/36 خالص سازی شد.</span></p> <p dir="RTL" style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong><span dir="RTL">نتیجه گیری: </span></strong></span><span dir="RTL">بر اساس نتایج این مطالعه </span><span dir="RTL">فرم غیر فعال و</span> <span dir="RTL">ایمونوژن </span>PTX<span dir="RTL"> سویه غالب بیماریزا در ایران می تواند به تنهایی و یا در ترکیبی با سایر آنتی ژنها جهت طراحی واکسن های بدون سلولی مورد استفاده قرارگیرد</span></span></p> <p dir="RTL" style="margin-right: -28.15pt; text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><strong><span dir="RTL">نتی</span></strong></span></p> <p style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong>BACKGROUND AND OBJECTIVE:</strong></span> Whooping cough is an acute contagious human respiratory disease especially in infants and children and is one of the ten major causes of death from infectious diseases. Despite reducing the risk due to vaccination with killed bacteria pathogen (Bordetella pertussis), increased disease emerged in recent decades indicates re-emerging due caused by genetic diversity of bacteria and the insufficiency of current vaccines. Therefore, the design of new and effective vaccines based on common strains of the population is essential. In this study the prevalent strain Iranian <em>B.pertussis</em> strains has been selected for gene amplification of pertussis toxin (PTX), the most important antigen of bacteria. The toxicity of the PTX related to its enzymatic activity therefore by site directed mutagenesis, the effective residues in the active site of the enzyme has been changed and the inactive and safe recombinant was produced.</span></p> <p style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong>METHODS:</strong> </span>Bacterial strain used in this study to determine the genome and gene amplification was selected from pathogenic strains isolated from Iranian patients from the pertussis reference laboratory of Microbiology of the Pasteur Institute of Iran. Genomic DNA was extracted by kit, <em>ptx- s1</em>(the enzymatic fragment of PTX) fragments amplified and inserted in pUC18. Site directed mutagenic primers were used for substitution of Arg 9 by Lys and Glu129 by Gly.&nbsp; The confirmed mutant <em>ptx- s1</em> (<em>mptx-s1</em>) was sub-cloned into expression vector pET15b. The expression of recombinant protein in <em>E.coli BL21</em> was induced by 0.5mM IPTG. The expression was analyzed by SDS-PAGE and immuno-blotting. The protein was puifird by Ni-NTA affinity chromatography under denature condition.</span></p> <p style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong>FINDINGS:</strong></span> Sequencing data and restriction enzyme analysis confirmed the gene constructing and mutations. The presence of a 28 kDa band in SDS-PAGE and immunoblot showed the expression of mutant PTX. The concentration of recombinant protein was 0.36 mg/ml<span dir="RTL">.</span></span></p> <p style="text-align: justify;"><span style="font-family:times new roman;"><span style="color:#0000FF;"><strong>CONCLUSION:</strong></span> The Recombinant protein which was obtained in this study provided the possibility of designing acellular vaccines on the basis of important antigens of prevalent strain of<em> B.pertussis </em>in Iran.</span></p> بوردتلا پرتوسیس, توکسین, واکسن غیر سلولی, جهش زایی هدفمند B .Pertussis, Toxin, Acellular Vaccine, Site-Directed Mutagenesis 20 25 http://jbums.org/browse.php?a_code=A-10-2716-1&slc_lang=fa&sid=1 B Kahali بهرام کحالی 100319475328460026115 100319475328460026115 No Department of Microbiology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش میکروب شناسی، انستیتوپاستور ایران VS Nikbin وجیهه سادات نیکبین vsnikbin@yahoo.com 100319475328460026116 100319475328460026116 No Department of Microbiology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش میکروب شناسی، انستیتوپاستور ایران F Shahcheraghi فرشته شاهچراغی 100319475328460026117 100319475328460026117 No Department of Microbiology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش میکروب شناسی، انستیتوپاستور ایران F Kazemi فائقه کاظمی 100319475328460026118 100319475328460026118 No Department of Microbiology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش میکروب شناسی، انستیتوپاستور ایران M Rafipour مریم رفیع پور 100319475328460026119 100319475328460026119 No Department of Microbiology, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش میکروب شناسی، انستیتوپاستور ایران M Keramati ملیحه کرامتی mlh_keramati@yahoo.com 100319475328460026120 100319475328460026120 Yes Nano-Biotechnology Department, Pasteur Institute of Iran, Tehran, I.R.Iran بخش نانو بیوتکنولوژی، انستیتوپاستور ایران