Journal of Babol University of Medical Sciences

fa بیان و سنتز فاکتور VIII انعقادی نوترکیب انسانی با استفاده از سیستم بیانی بدون سلول Expression and Synthesis of Recombinant Human Coagulation Factor VIII Using a Cell-Free Expression System ژنتیک، بیولوژی سلولی و مولکولی Genetics, Cell and Molecular Biology تجربی Experimental <div style="text-align: justify;">سابقه و هدف: بیماری هموفیلی نوع A، شایع‌ترین نوع این بیماری است. جهت درمان بیماران هموفیلی، کنسانتره تزریقی فاکتور VIII انسانی، به دو صورت مشتق از پلاسما و نوترکیب در بازار وجود دارد. با توجه به خطر ابتلا به بیماری‌های عفونی در اثر تزریق خون یا محصولات خونی اهدایی از جمله فاکتور VIII مشتق از پلاسما، می‌توان از فاکتور VIII نوترکیب که از لحاظ ایمنی بی‌خطر، دارای خلوص بالاتر از نمونه مشتق از خون بوده و نیز نیمه عمر طولانی‌تری در خون بیماران مصرف کننده دارد، استفاده نمود. هدف از این مطالعه، بیان و سنتز فاکتور VIII نوترکیب انسانی با استفاده از سیستم بیانی یوکاریوتی عاری از سلول به عنوان استراتژی نوین سنتز داروهای نوترکیب می‌باشد. مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی وکتور pcDNA3 حاوی قطعه ژنی بدون دمین B فاکتور VIII انعقاد خون، به داخل باکتری DH5α مستعد شده، ترانسفورم گردید. پس از تکثیر باکتری و افزایش وکتور مورد نظر، در این مرحله وکتور تکثیر یافته استخراج شد و کیفیت و غلظت آن تعیین گردید. سپس سلول‌های یوکاریوتی CHO-K1 کشت داده شدند و از تراکم بیش از ده میلیون سلول آن‌ها، عصاره سلولی تهیه شد. وکتور استخراج شده با عصاره سلولی و محلول بیانی ترکیب و فرآیند بیان در دمای °C30 و °C37 انجام شد. میزان بیان با تکنیک‌های الایزا و دات بلات بررسی گردید. یافته‌ها: در این پژوهش با تکنیک الایزا میزان بیان فاکتور VIII انعقاد خون نوترکیب انسانی در نمونه پایه با دمای °C30، نمونه 2 با دمای °C30، نمونه پایه با دمای °C37 و نمونه 4 کنترل منفی با دمای °C30 در مدت 20 ساعت به ترتیب 275، 276، 273 و صفر نانوگرم در میلی‌لیتر گزارش شد. در تکنیک دات بلات نیز نتایج کمی ذکر شده به صورت کیفی با شدت رنگ لکه‌ها تائید گردید. نتیجه‌گیری: نتایج حاصل نشان داد که از روش بیان عاری از سلول می‌توان برای سنتز فاکتور VIII نوترکیب استفاده نمود. شرایط بکار گرفته شده در این پژوهش جهت بیان بدون سلول فاکتور VIII نوترکیب، نسبت حجمی 50/50 از عصاره سلولی CHO-K1 مناسب بوده است و محلول بیانی پایه در دمای °C30 بیشترین غلظت محصول را بیان نمود. به دلیل استفاده از عصاره سلولی یوکاریوتی CHO-K1، فاکتور VIII نوترکیب انسانی سنتز شده دارای تغییرات پس از ترجمه است که جهت عملکردی بودن این پروتئین در بدن انسان بسیار مهم می‌باشد.  </div> <div style="text-align: justify;">Background and Objective: Hemophilia A is the most common type of this disease. For the treatment of hemophiliacs, the injectable concentrate of human factor VIII, derived from plasma and recombinant, is available in the market. Due to the risk of contracting infectious diseases due to blood transfusions or donated blood products, including plasma-driven factor VIII, recombinant factor VIII can be used, which is safe and has a higher purity than the blood-derived sample, while showing a longer half-life in the blood of consuming patients. The aim of this study is to evaluate the expression and synthesis of recombinant human factor VIII using a cell-free eukaryotic expression system as a new strategy for the synthesis of recombinant drugs. Methods: In this experimental study, pcDNA3 vector containing the gene fragment without B-domain of blood coagulation factor VIII was transformed into susceptible DH5α bacteria. After the multiplication of the bacteria and the increase of the target vector, the amplified vector was extracted at this stage and its quality and concentration were determined. Then CHO-K1 eukaryotic cells were cultured and cell extract was prepared from the density of more than ten million of their cells. The extracted vector was combined with cell extract and expression solution, and the expression process was carried out at 30°C and 37°C. The level of expression was evaluated by ELISA and dot blot techniques. Findings: Based on the ELISA technique adopted in this study, the expression level of recombinant human blood coagulation factor VIII in the base sample at a temperature of 30°C, sample 2 at a temperature of 30°C, base sample at a temperature of 37°C, and sample 4 of negative control at a temperature of 30°C were respectively reported as 275, 276, 273 and 0 ng/ml in a period of 20 hours. In the dot blot technique, the mentioned quantitative results were qualitatively confirmed by the color intensity of the spots. Conclusion: The results showed that the cell-free expression method can be used for the synthesis of recombinant factor VIII. Under the conditions used in this research for cell-free expression of recombinant factor VIII, volume ratio of 50/50 of CHO-K1 cell extract was suitable, and the basic expression solution at 30°C showed the highest concentration of the product. Due to the use of CHO-K1 eukaryotic cell extract, the synthesized recombinant human factor VIII has post-translational modifications, which are very important for the functionality of this protein in the human body.</div> فاکتور VIII نوترکیب انسانی, رده سلولی CHO-K1, عصاره سلولی, بیان بدون سلولی. Recombinant Human Factor VIII, CHO-K1 Cell Line, Cell Extract, Cell-Free Expression. 0 0 http://jbums.org/browse.php?a_code=A-10-7744-1&slc_lang=fa&sid=1 M Ebrahimi محمدرضا ابراهیمی mohammadreza262@yahoo.com 100319475328460068983 0009-0008-8018-9486 No 1.Student Research Committee, Babol University of Medical Sciences, Babol, I.R.Iran. 1. کمیته تحقیقات دانشجویی، دانشگاه علوم پزشکی بابل، بابل، ایران E Ferdosi-Shahandashti الهه فردوسی شاهاندشتی elaheh.ferdosi@yahoo.com 100319475328460068984 100319475328460068984 Yes 2.Biomedical and Microbial Advanced Technologies (BMAT) Research Center, Health Research Institute, Babol University of Medical Sciences, Babol, I.R.Iran. 2. مرکز تحقیقات فناوری‌های نوین زیست پزشکی و میکروبی، پژوهشکده سلامت، دانشگاه علوم پزشکی بابل، بابل، ایران M Zarei محبوبه زارعی mahboobehzarei70@gmail.com 100319475328460068985 0009-0005-3054-0547 No 3.Cellular and Molecular Biology Research Center, Health Research Institute, Babol University of Medical Sciences, Babol, I.R.Iran. 3. مرکز تحقیقات بیولوژی سلولی و مولکولی، پژوهشکده سلامت، دانشگاه علوم پزشکی بابل، بابل، ایران GA Kardar غلامعلی کاردر gakardar@tums.ac.ir 100319475328460068986 100319475328460068986 No 4.Immunology, Asthma and Allergy Research Center, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, I.R.Iran. 4. مرکز تحقیقات ایمونولوژی، آسم و آلرژی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران